海藻糖新型生物分子保護劑

海藻糖簡介

海藻糖(Trehalose)也被稱作α-D-吡喃葡萄糖基α-D-吡喃葡萄糖苷,由于兩個吡喃葡萄糖環的連接發生在糖基的還原末端(α-carbons),不會輕易地被酸水解,并且糖苷鍵不會被α-糖苷酶分解,所以海藻糖是具有很強的穩定性非還原性雙糖。海藻糖的研究已經有近百年的歷史,自發現以來,不斷從對外界惡劣環境表現出非凡抗逆耐受力的物種中發現海藻糖的存在,從而發現了海藻糖對生物體具有神奇的保護作用,是因為海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環境條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜,有效地保護蛋白質分子不變性失活,而后更多的研究將海藻糖應用到了食品、化妝品、藥品、生物制品的工藝中。

海藻糖在生物制品中的應用

在生物制品的凍干保護劑的制劑過程中,糖類是重要的一類輔料,比如蔗糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、麥芽糖等,其中蔗糖是在生物制品中使用廣泛,但由于國際藥用輔料協會對生物制品的質量、安全性日趨提高的要求,尋找更好的生物大分子保護穩定劑,提高生物制品的穩定性和質量是各大生物制藥公司不斷追尋的目標。迄今為止,在國際上,海藻糖已經陸續被使用到各類生物制品的凍干保護中,比如國際重磅生物炸彈藥,比如Herceptin?,Adcetris?,Avastin?,Lucentis?,Advate?,Gazyva?,Blincyto?,當中就使用了海藻糖作為核心的凍干保護劑,另外,也在越來越多的人用疫苗中,比如MenAfrivac,DengVaxia,HepB?(ShanVac),Influenzae (DPIV),MMR開始使用海藻糖替換血清白蛋白作為保護劑,可以常溫條件下干燥存放,不僅可以避免疫苗因為非冷鏈運輸導致的失效問題,而且還能防止因為血源污染導致的乙肝、艾滋病等致命疾病的傳播。

海藻糖相比蔗糖具有更加優質保護作用的原因

?1.?海藻糖和蔗糖物理性質比較

性質

海藻糖

蔗糖

Solubility (g/100 g H20, at 20°C)

40.6-68.9?

200

Melting temperature (°C)

210-215

188

Glass transition temperature (Tg, °C)

110-120

65-75

Relative viscosity

1.85

1.3

# Equatorial -OH

8

46

Diffusion coefficient (cm2/s)

1.91 x 10-8

5.89 x 10-8

Density (g/cm3, at 25°C and 85°C)

1.58,1.41

1.59,1.37

Hydration number

11

8

Rate of hydrolysis (s_1, at 25°C)

3.3 x l-15

5.0 x l-n

Stability in extreme pH (% remaining)

>99%

^0%?at pH 3-4

Acrylamide formation

0 mg/mol Asn

98 mg/mol Asn

Calcium dissolution in phosphate buffer

24 ppm

6 ppm

Sweetness

45%

100%

?

1.?玻璃態轉變溫度Tg

在不同的干燥或失水過程中,包括冷凍干燥和噴霧干燥,海藻糖可輕易地干燥為非晶體材料,并具有高玻璃態轉變溫度(Tg100°C[12,3]。不同文獻中報道的Tg有所不同,導致不同結果的原因是由于不同的檢測條件,其中最重要的因素是殘余水分含量。Crowe等人所報道的在殘余水分含量為0.3%時,Tg111.3°C[4]。隨著水分的增加,Tg降低,這是水的增塑作用導致的。盡管如此,在含水量相似的情況下,海藻糖的Tg值高于蔗糖(圖1)。?

1.?海藻糖和蔗糖玻璃態轉變溫度(Tg)與含水量(wt%)的相關性[4,5]。

2.?水解穩定性

水解速率對活性生物制品的穩定有著深遠的影響,因為還原性單糖,如葡萄糖,易于發生美拉德反應(或褐變反應)。海藻糖對于水解的穩定性是因為海藻糖中的糖苷鍵具有較低的能量(<1 kcal/mol[5,6],而蔗糖中糖苷鍵的自由能更高(27 kcal/mol),二水化合物晶體的水解溫度高達97°C[7,8],而且在弱酸存在的情況下,蔗糖更易于水解產生葡萄糖和果糖,而海藻糖在ph3.0的情況下仍然非常穩定。在另一項研究中,在沒有酸催化的條件下,海藻糖的水解速率也明顯低于蔗糖:在25°C時,分別為3.3 ×10?15 s?15 × 10?11 s?1[9]。這兩種糖類水解速率和溫度的相關性如圖2所示,而且研究表明這些速率不隨pH和離子強度的變化有顯著改變。此外,有文獻報道蔗糖在冷凍過程中可發生水解,然而海藻糖并沒有類似的報告[10-12]。

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2.?海藻糖和蔗糖水解速率比較。0.1 M PBSpH8.1),溫度范圍100°C?-240°C[9]。

3.?低吸濕性

與此同時,在一些應用中,如片劑制劑,相對于其他糖類,結晶態海藻糖還有一個優勢,即他低吸濕性,從而促進藥片粘性的降低和穩定性的提高。在海藻糖和蔗糖不同物理性質的比較中,這些性質的不同大約是由于它們構象柔性不同所導致的。大多數二糖,構象受單糖殘基間的分子內氫鍵影響。結晶態下的海藻糖,不存在直接的分子內氫鍵[13],而在蔗糖內就存在這樣的氫鍵[14]。盡管如此,海藻糖內還是存在間接的通過水分子表現的分子間氫鍵[13-15],平均鍵長相對較短(1.825 ?)。因此,相對作用較強[16]。對于海藻糖和蔗糖,環氧原子的角度分別是114.1°116.1°,而糖苷氧原子的角度分別是115.8°114.4°[13-17]。這兩種糖類的其他結晶學數據可在這些文獻中找到[13,16-18]。

3.?不同糖類晶體狀態下吸水性。25°C,相對濕度90%[19]。

4.?高水合性

海藻糖還有一個明顯的特點就是具有較高數量的Equatorial –OH基團,這使海藻糖在水溶液中有更強的相互作用,并更容易把它自己包含在水分子簇中。相反的,蔗糖不能很好的把自己整合在水分子簇中,從而造成了更大的結構[20]。事實上,相對于海藻糖,蔗糖更不容易與水結合。(圖4)這一特點的實際意義說明,對于基于蔗糖的配方,在低含水量(如<1%)時,含海藻糖配方更不容易水解。

除以上原因外,兩種糖類的性質的不同也可能是由于分子間氫鍵數量的不同導致的(尤其是在高濃度下)。海藻糖只形成一個這樣的鍵,而蔗糖會形成兩個,因此,對于海藻糖會有更多空閑的位點與水分子的氫鍵結合,從而導致了更高的水合數量[21,22]。隨著海藻糖濃度(5-90wt%)的增加,水合數量遞減(大約從133)。圖4中的這種減少是由于犧牲糖分子附近的水分子造成的,迫使它們通過增加分子內氫鍵的方式減少對氫鍵的需求。這種方式形成了一種折疊的構象,進而減少水合數量[21-24]。紅外線光譜和激光拉曼光譜等技術用來驗證蔗糖分子糖苷鍵周圍的折疊情況,然而這種構象的改變在海藻糖中沒有發現[26]。

4.?海藻糖和蔗糖水合數量與糖類濃度(wt%)相關性[21]

5.?更低的水擴散系數和更高的粘性

海藻糖和蔗糖的物理性質比較說明了,雖然密度相似,海藻糖具有更低的水擴散系數和更高的粘性[21]。所有性質之間都是緊密聯系的。隨著密度增加,自由體積減少,所以擴散性降低,粘性增加[26]。蔗糖的擴散系數要高于海藻糖,尤其是在高濃度的情況下:74wt%糖濃度,蔗糖和海藻糖的擴散系數分別是5.89 × 10?81.91 × 10?8 cm2/s。更快的擴散系數是由于蔗糖具有更小的水合數造成的。因為水合的蔗糖在尺寸上更小,所以它更易擴散。然而,在低濃度時,系統中水分子相對顯著增多,涉及其中的糖類并不敏感,所以沒有發現擴散性的不同。隨著系統中糖類流動性限制的增加,粘性預計會增加。事實上,Sola-PennaMeyer-Fernandes[27]的研究表明海藻糖粘性高于蔗糖,并且在更高的濃度下,差距增加。圖5中這說明在具有高濃度蛋白的應用中,含海藻糖的配方具有更高的整體粘性。

????????????????????5.?濃度范圍在0-1 M,海藻糖和蔗糖相對粘性[25]。

另外,在細胞凍存,細胞培養等方面,海藻糖也有相對一般糖類同樣具有非常明顯的優勢,如果您對這方面內容感興趣,歡迎關注西美杰公眾號(xmjsci)后期推送內容,或者致電西美杰客服熱線400-050-4006進行咨詢。

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